一种可在细菌中广谱应用的基因操作手段的开发利用 李海娟

一、背景、研究目的与意义
细菌在工业微生物发酵中占据重要地位。如：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）可生产多种蛋白酶、淀粉酶、及多肽类抗生素、氨基酸等； 谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum ） 可生产谷氨酸和其他多种氨基酸； 德式乳酸菌（Lactobacillus delbruckii）可生产乳酸；假单胞菌（Pseudomonas）可生产维生素B12、
丙氨酸、谷氨酸、葡萄糖酸、色素、果胶酶和脂肪酶等多种产品；丙酮-丁醇梭菌（Clostridiumacetobutylicum）可生产丙酮、丁醇等有机溶剂，有成为新生态的能源的潜力。在发酵生产中所用的菌种都源于自然界，但又都带上人类遗传操作的痕迹。自然界中筛选获得的菌株，都需经过精心选育，达到生产菌种要求才可作为生产菌种。因此，工业微生物育种选育在生物发酵产业中占有重要地位，是决定发酵产品能否具有工业化价值及发酵过程成败的关键。随着微生物育种的发展，基因工程菌的构建和应用，已在多方面显示了其巨大的生命力。通过基因工程育种的方法生产药物，已获得了包括治疗用药物、疫苗、单克隆抗体及诊断试剂等多种获得上市的品种。特别是近年来，通过调节微生物的代谢途径而使生物合成途径朝着人们所希望的方向进行，即所谓的代谢控制育种得到了迅速的发展，收到了良好的效果，带来了巨大效益。要使细菌从错综复杂的代谢途径中积累最大量的目标产物，其中关键一点是要有可行的、便洁的基因工程操作手段来人为更改代谢途径。例如，通过基因敲除的方法来解除某阻遏物的反馈调节，使目标产物最大量合成。尽管如此，目前还尚未见能在多种细菌中得到广泛应用的遗传操作手段，极大程度地限制了人们对工业细菌的认识和充分利用。因此，开发一种可在多种细菌中广泛应用的遗传操作手段刻不容缓。迄今，最常用的细菌基因敲除手段是利用能表达对特定抗生素（如卡那霉素、博来霉
素和潮霉素等）具有抗性的蛋白质的标记基因（antibiotic resistence marker）来对目标基因（target gene）进行取代敲除（Lasa et al.,1992; Mather and Fee, 1992; Brounset al., 2005）。这种方法虽然简单，却有不可避免的缺点，如：（1）该抗性标记基因不可在该突变株的遗传背景中得到再次利用；（2）在突变株中，抗性标记基因的启动子很可能会对下游基因的表达造成严重影响，即极性效应（polar effect），导致代谢途径改变达不到预期效果。为了避免上述缺点，得到优良的突变株，人们也尝试了一些无痕基因敲除方法（marker-free gene deletion approches），即目标基因被完全敲除，没有在基因组中引入任何不相关遗传背景（如上述的抗性标记基因）（Maloy and Nunn, 1981; Gay et al.,1985; Fabret et al., 2002; Bitan-Banin et al., 2003）。一般来说，这种无痕基因敲除的方法在细菌转化载体后要经过两步筛选能得到突变株（详细步骤见图1）：第一步，通过抗生素筛选（即正向筛选）将载有抗性标记基因、目标基因两侧的DNA 序列（flankingregions）、能进行第二步筛选的基因（即反向筛选标记基因）、以及其他相关必须片段的整个载体插入到细菌基因组相应位置中；第二步，通过重复DNA 序列（即由载体引入的目标基因的两侧序列与基因组中原有两侧序列是重复的）的同源重组过程（homologousrecombination），将第一步中插入的整个载体切除。要判断载体是否被切除，就要依靠载体上含有的反向筛选标记基因（counter-selection marker）。一般意义上，这种被选作为反向筛选标记的基因表达的蛋白产物在特定的培养条件下能对该菌株生长具有强烈抑制作用。由此，容易得知，在第二步筛选中使用此特定的培养条件，未发生同源重组，即载体未被切除的转化子是不能生长的；与此相反，发生过同源重组，载体被切除的转化子可以在这种特定条件下生长。由于目标基因的两侧序列是两段，发生同源重组也有两种可能性：一种同源重组会保留目标基因，产生的转化子是野生型；另一种同源重组会彻底切除目标基因，产生的转化子即是突变株。理论上，这两种可能性各占50%，通过随机挑选克隆、培养、后续基因型（genotype）分析等步骤得到基因敲除突变株的几率理论上也是50%。综上所述通过此种无痕迹基因敲除的遗传操作手段来改造目的菌株的相关代谢途径，从而开发出新的、更具生产价值的基因工程菌具有可行性与重大研究意义。
图1

图1：基于高浓度（500 μg/μl）的5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-d-吡喃葡萄糖苷（BCI-β-glu）底物对能表达β-葡萄糖苷酶的高温噬热菌Thermus thermophilus HB27 的生长抑制作用原理，构建出的基因敲除流程图。pTKO-4 为载体名称，载体分别含有以下关键元件：bgl 代表T. thermophilus 中表达β-葡萄糖苷酶的基因；kat 代表能在T. thermophilus 中能成功表达卡那霉素抗性蛋白的基因，该基因启动子为slp；MCS 代表多克隆抗性位点。白色矩形代表目标基因的两侧序列中的上游序列，浅灰色矩形代表目标基因的下游序列，黑色矩形代表待敲除的目标基因。将目标基因两侧序列融合并克隆到pTKO-4 载体中，紧接着将得到的载体转化到T. thermophilus 中，第一步在含有卡那霉素（kan 20μg/μl）的平板上筛选具有卡那霉素抗性的转化子（即整个载体整合到基因组中）。第二步，第一步中得到的转化子由于具有重复序列（图中分别具有两个白色与黑色矩形），部分转化子细胞内将发生同源重组。若此过程发生，第一步中介入的载体将会被整体切除，产生的转化子由于不具备β-葡萄糖苷酶，便可以在还有500 μg/μl 的BCI-β-glu 底物的平板上生长。理论上，平板上50%的菌落为目标基因被敲除的突变株（mutant）。
二、前期成果
从以上所述可得知，为了得到优良突变株而采用的无痕基因敲除的方法中关键因素是能找到合适的反向筛选标记基因，以及相对应的特殊培养条件，从而使具有该标记基因的菌株在此特定条件下无法生长，而相反缺失该标记的菌株能正常生长。在之前的研究工作中，以高温噬热菌Thermus thermophilus HB27 为研究对象，我们发现了这样一种反向筛选标记基因，即表达β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase）的基因bgl。我们的研究表明，在含有高浓度（ 500 μ g/ μ l ） 底物5- 溴-4- 氯-3- 吲哚基- β -d- 吡喃葡萄糖苷（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-glucoside，此文中简称BCI-β-glu）的培养基中，T. thermophilus 的野生型无法生长，而bgl 基因被敲除的突变株（Δbgl）却能正常生长（图2）。利用此在特定底物下，生长受抑制的特性，我们将bgl 基因作为一个无痕基
因敲除方法中的反向筛选标记基因，成功敲除了T. thermophilus HB27 中的多个基因（图3，以基因位点TT_C340 为例）。
图2

图2：（A）培养平板上显示5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-d-吡喃葡萄糖苷（BCI-β-glu）底物对能表达β-葡萄糖苷酶的T. thermophilus 具有抑制生长作用。将野生型T. thermophilus（wt）和bgl 基因被敲除的突变株（Δbgl）的新鲜菌液按1:1 的浓度混合并进行涂板。由图可见，随着BCI-β-glu底物浓度的增长（从0 到500 μg/μl），野生型菌落（由于β-葡萄糖苷酶分解BCI-β-glu 底物，菌落呈深蓝色）逐渐变小，在底物浓度500 μg/μl 时，生长完全被抑制。相反，Δbgl 菌株的菌落（由于β-葡萄糖苷酶基因被敲除，不能完全分解BCI-β-glu 底物，菌落呈微带蓝的橙黄色（野生型T.thermophilus 为橙黄色））却能正常生长。（B）通过数存活细胞数量证明BCI-β-glu 底物对能表达β-葡萄糖苷酶的T. thermophilus 具有抑制生长作用。将分别含有相同细胞数量的T. thermophilus 野生型（wt）与Δbgl 突变株菌液分别接菌到含有一系列不同浓度的BCI-β-glu 底物液体培养基中，并在相同条件下生长15h 后进行活细胞数量分析。黑圈代表野生型在不同BCI-β-glu 底物种的存活细胞数量；白圈代表Δbgl 突变株在不同BCI-β-glu 底物中的存活细胞数量。以上两个实验证明结合BCI-β-glu 底物的使用，bgl 基因可在T.thermophilus 中作为一个基因无痕敲除的反向筛选标记手段。
图3

图3：结合BCI-β-glu 底物的使用， 利用bgl 基因为反向筛选标记基因，成功敲除了T.thermophilus 中的TT_C340 基因。1 到7 分别代表为第二步筛选后，随机挑选出的7 个克隆，由左图（PCR 验证单克隆的基因型）和右图（Southern blot 验证单克隆的基因型）可见，随机挑选出的7 个克隆中4 个的基因型与野生菌株相同（克隆1、2、4 和7），3 个基因型为突变株（克隆3、5 和6）。因此达到了理想的近50%的突变株获得几率。
三、后续工作展望
不仅是T. thermophilus，其他诸多革兰氏阳性、革兰氏阴性的细菌，其基因组中基本都含有能表达葡萄糖苷酶（glucosidase）、半乳糖苷酶（galactosidase）、或者更普遍的碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）等这些水解酶的基因。例如：含有一个或者全部这些基因的、同时具有诸多工业利用价值细菌有地衣形芽孢杆菌（ Bacilluslicheniformis）、谷氨酸棒状杆菌（C. glutamicum）、藤黄微球菌（Micrococcus luteus）、野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）以及恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）等。同时，这些酶相对应的底物即吲哚基取代底物（substituted indoxyl substrates），如上述研究中已用过的BCI- β -glu 、5- 溴-4- 氯-3- 吲哚基- α -d- 吡喃葡萄糖苷（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-α-d-glucoside）、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-d-吡喃半乳糖苷（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-galactoside）、以及5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸（5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate）等在市场上也有广泛的销售。这两种条件的具备意味着只要某细菌中存在如上所述的水解酶之一，能导致该菌对相对应的底物产生敏感性，即底物浓度达到一定值，生长就会受到抑制。这些相对应的水解酶基因就可被选为该菌基因无痕敲除手段中的反向筛选标记基因（counter-selection marker），结合相对应的底物进行筛选，便能成功敲除目标基因。这为成功实现工业细菌的代谢途径的改造，使目标产物大量积累，为造就优良发酵菌种提供先决条件。
五、项目团队成员组成
项目联系人：
李海娟，德国慕尼黑工业大学微生物学博士，西安文理学院生物与环境工程学院讲师。
联系方式：haijuanlee@sina.com，手机号15091775921。
团队成员
徐玲玲，中国科学院微生物研究所微生物学博士，西安文理学院生物与环境工程学院副教授。
苏丽艳，法国图卢兹国立理工大学&图卢兹农科院分子生物学专业博士研究生，西安文理学院生物与环境工程学院讲师。